BAB I
PENDAHULUAN
A.
LATAR
BELAKANG
Pengetahuan tentang sejarah dan terminologi, prinsip dasar dan tipe-tipe kultur
jaringan akan mendasari pemahaman mahasiswa tentang berbagai konsep lanjut yang
berhubungan dengan aplikasi kultur jaringan untuk beberapa tujuan tertentu
misalnya perbanyakan tanaman secara cepat dan efisien, produksi metabolit
sekunder dan sebagainya.
Sejarah perkembangan teknik
kultur jaringan dimulai pada tahun 1838 ketika Schwann dan Schleiden
mengemukakan teori totipotensi yang menyatakan bahwa sel-sel bersifat otonom,
dan pada prinsipnya mampu beregenerasi menjadi tanaman lengkap.
B. TUJUAN
Tujuan
penyusunan makalah ini yaitu untuk memahami
perkembangan teknologi kultur jaringan tanaman ditinjau dari perspektif
sejarahnya dan dapat menggunakan secara tepat beberapa terminologi penting dari
teknologi ini
BAB II
PEMBAHASAN
A. SEJARAH PERKEMBANGAN KULTUR JARINGAN
Sejarah perkembangan teknik kultur jaringan dimulai
pada tahun 1838 ketika Schwann dan Schleiden mengemukakan teori totipotensi
yang menyatakan bahwa sel-sel bersifat otonom, dan pada prinsipnya mampu beregenerasi
menjadi tanaman lengkap. Teori yang dikemukakan ini merupakan dasar dari
spekulasi Haberlandt pada awal abad ke-20 yang menyatakan bahwa jaringan
tanaman dapat diisolasi dan dikultur dan berkembang menjadi tanaman normal
dengan melakukan manipulasi terhadap kondisi lingkungan dan nutrisinya.
Walaupun usaha Haberlandt menerapakan teknik kultur jaringan tanaman pada tahun
1902 mengalami kegagalan, namun antara tahun 1907-1909 Harrison, Burrows, dan
Carrel berhasil mengkulturkan jaringan hewan dan manusia secara in vitro.
Keberhasilan aplikasi teknik kultur jaringan sebagai sarana perbanyakan tanaman
secara vegetatif pertama kali dilaporkan oleh White pada tahun 1934, yakni
melalui kultur akar tomat. Selanjutnya pada tahun 1939, Gautheret, Nobecourt,
dan white berhasil menumbuhkan kalus tembakau dan wortel secara in vitro.
Setelah Perang Dunia II, perkembangan teknik kultur jaringan sangat cepat, dan
menghasilkan berbagai penelitian yang memiliki arti penting bagi dunia
pertanian, kehutanan, dan hortikultura yang telah dipublikasikan.
Pada awalnya, perkembangan teknik kultur jaringan tanaman berada di belakang
teknik kultur jaringan manusia. Hal itu disebabkan lambatnya penemuan hormon
tanaman (zat pengatur tumbuh). Ditemukakannya auksin IAA pada tahun 1934 oleh
Kögl dan Haagen-Smith telah membuka peluang yang besar bagi kemajuan kultur
jaringan tanaman. Kemajuan ini semakain pesat
setelah ditemukannya kinetin (suatu sitokinin) pada tahun 1955 oleh Miller dan
koleganya. Pada tahun1957, Skoog dan Miller mempublikasikan suatu tulisan
”kunci” yang menyatakan bahwa interaksi kuantitatif antara auksin dan sitokinin
berpengaruh menentukan tipe pertumbuhan dan peristiwa morfogenetik di dalam
tanaman. Penelitian kedua ilmuwan tersebut pada tanaman tembakau mengungkapkan
bahwa rasio yang tinggi antara auksin terhadap sitokinin akan menginduksi
morfogenesis akar, sedangkan rasio yang rendah akan menginduksi morfogenesis
pucuk. Namun pola yang demikian ternyata tidak berlaku secara universal untuk
semua spesis tanaman.
Ditemukannya prosedur perbanyakan secara in vitro pada tanaman anggrek Cymbidium
1960 oleh Morel, serta diformulasikannya komposisi medium dengan konsentrasi
garam mineral yang tinggi oleh Murashige dan Skoog pada tahun 1962, semakin
merangsang perkembangan aplikasi teknik kultur jaringan pada berbagai spesies
tanaman. Perkembangan yang pesat pertama kali dimulai di Perancis dan Amerika,
kemudian teknik inipun di kembangkan di banyak negara, termasuk Indonesia,
dengan prioritas aplikasi pada sejumlah tanaman yang memiliki arti penting bagi
masing-masing negara.
Meningkatnya penelitian kultur jaringan dalam dua dekade terakhir telah memberi
sumbangan yang sangat besar bagi ahli pertanian, pemuliaan tanaman, botani,
biologi molekuler, biokimia penyakit tanaman, dan sebagainya. Karena kultur
jaringan telah mencapai konsekuensi praktis yang demikian jauh di bidang
pertanian, pemuliaan tanaman dan sebagainya maka dapat dipastikan junlah
penelitian dan aplikasi teknik ini akan terus meningkat pada masa-masa
mendatang. Pierik (1997) mengemukakan sejumlah peristiwa penting dalam sejarah
perkembangan kultur jaringan hingga dekade 1980 an sebagai berikut;
1892 Ditemukan
fenomena sintesis senyawa-senyawa pembentuk organ yang didistribusikan secara
polar di dalam tanaman.
1902 Usaha perrtama aplikasi kultur jaringan tanaman.
1904 Usaha
pertama aplikasi kuktur embrio sejumlah tanaman Cruciferae
1909 Fusi protoplas tanaman, namun produk yang dihasilkan
mengalami kegagalan untuk hidup.
1922 Perkecambahan in vitro biji anggrek secara
asimbiosis.
1922
Kultur in vitro ujung akar
1925
Aplikasi kultur embrio pada tanaman Linum hasil silang antar spesies
1929
Kultur embrio Linum untuk menghindari inkompatibilitas persilangan
1934
Kultur in vitro jaringan kambium dari sejumlah tanaman pohon dan perdu
mengalami kegagalan karena tidak adanya ketrelibatan auksin
1934
Keberhasilan kultur akar tanaman tomat.
1936
Kultur embrio sejumlah tanaman Gymnospermae
1939
Keberhasilan menumbuhkan kultur kalus secara kontinu
1940
Kultur in vitro jaringan kambium dari tanaman Ulmus untuk
mempelajari pembantukan tunas adventif
1941
Air kelapa (Yang mengandung faktor pembelahan sel) untuk pertama kalinya
digunakan pada kultur embrio tanaman Datura
1941
Kultur in vitro jaringan tumor crown-gall
1944
Untuk pertama kalinya kultur in vitro tembakau digunakan pada penelitian
pembantukan tunas adventif
1945
Budi daya potongan tunas tanaman Asparagus secara in vitro
1946
Untuk pertama kalinya diperoleh tanaman Lupinus dan Tropaelum
dari kultur pucuk
1948
Pembentukan akar dan tunas adventif tanaman tembakau ditentukan oleh rasio
auksin : adenin
1950
Regenerasi organ tanaman dari jaringan kalus Sequoia sempervirens.
1952
Aplikasi sambung mikro (micrografiting) untuk pertama kalinya
1953
Produksi kalus haploid tanaman Ginkgo biloba dari kultur serbuk sari
1954
Pengkajian terhadap perubahan-perubahan kariologi dan sifat-sifat kromosom pada
kultur endosperm tanaman jagung
1955
Penemuan kinetin, yaitu suatu hormon perangsang pembelahan sel.
1956
Realisasi pertumbuhan kultur di dalam sistem multiliter untuk menghasilkan
metabolit sekunder.
1957
Ditemukannya pengaturan pembentukan organ (akar dan pucuk) dengan mengubah
rasio antara auksin dan sitokinin
1958
Regenerasi embrio somatik secara in vitro dari jaringan nuselus tanaman Citrus
ovules
1958 Regenerasi proembrio dari massa kalus dan suspensi
sel tanaman wortel
1959 Publikasi buku pegangan mengenai kultur jaringan
tanaman untuk pertama kali
1960 Keberhasilan pembuahan in vitro pada Papaver
rhoeas untuk pertama kalinya
1960 Degradasi dinding sel secara enzimatik untuk
memperoleh protoplas dalam jumlah besar.
1960
Perbanyakan vegetatif tanaman anggrek melalui kultur meristem
1960 Filtrasi suspensi sel dan isolasi sel tunggal
1962
Pengembangan medium dasar Murashige dan Skoog (MS)
1964
Produksi tanaman Datura haploid dari kultur serbuk sari untuk pertama kalinya
1964
Regenerasi tunas dan akar pada jaringan kalus tanaman Populus tremuloides
1965
Induksi pembungaan secara in vitro pada tanaman tembakau
1965
Diferensiasi tanaman tembakau dari isolasi sel tunggal pada kultur mikro
1967
Induksi pembentukan bunga pada Lunaria annua dengan vernalisasi secara in
vitro
1967
Produksi tanaman haploid dari kuktur serbuk sari tanaman tembakau (Nicotiana
tabacum).
1969
Analisis kariologi tanaman yang diregenerasikan dari kultur kalus tembakau.
1969
Keberhasilan isolasi protoplas dari kultur suspensi Haplopappus gracilis
untuk pertama kalinya
1970
Seleksi mutan biokimia secara in vitro
1970
Pemanfaatan kultur embrio untuk menghasilkan barley monoploid
1970
Keberhasilan peleburan protoplas untuk pertama kalinya
1971
Keberhasilan regenerasi tanaman dari kultur protoplas untuk pertama kalinya.
1972
Hibridisasi antarspesies melalui peleburan protoplas pada dua spesies Nicotiana
1973
Sitokinin diketahui mampu memecahkan dormansi pada eksplan jaringan kapitulum
tanaman Gerbera
1974
Induksi percabangan aksilar oleh sitokinin pada eksplan tunas tanaman Gerbera.
1974
Regenerasi Petunia hybrida haploid dari kultur protoplas.
1974
Diketahui bahwa peleburan protoplas haploid dapat dilakukan sehingga mendukung
hibridisasi
1974
Biotransformasi pada kultur jaringan tanaman
1974
Penemuan Ti-plasmid pada Agrobacterium sebagai senyawa penginduksi
pembentukan tumor
1975
Seleksi positif terhadap kultur kalus tanaman jagung yang resisten terhadap Helminthosporium
maydis.
1976
Inisiasi pucuk dari eksplan tunas tanaman anyelir yang berasal dari penyimpanan
pada suhu rendah (kreopreservasi).
1976
Hibridisasi antarspesies melalui peleburan protoplas pada tanaman Petunia
hybrida dan P. Parodii.
1976
Sintesis dan perombakan oktopin dan nopalin diketahui dikontrol secara genetis
oleh Ti-plasmid Agrobacterium tumefaciens.
1977
Keberhasilan integrasi DNA Ti-plasmid dari Agrobacterium tumefaciens
pada tanaman
1978
Hibridisasi somatik tomat dan kentang
1979
Pengembangan prosedur co-cultivation untuk teransformasi protoplas tanaman
dengan Agrobacterium
1980
Pemanfaatan sel untuk biotransformasi digitoksin menjadidigoksin
1981
Pengenalan istilah variasi somaklon atau keragaman somaklon
1981
Isolasi auksotrop melalui skrining berskala besar terhadap koloni sel yang
diperoleh dari protoplas haploid tanaman Nicotiana plumbaginifolia
dengan perlakuan mutagen.
1982
Protoplas dapat bergabung dengan DNA telanjang sehingga memungkinkan untuk
dilakukannya transformasi dengan isolasi DNA.
1983 Hibidisasi sitoplasma antargenus pada tanaman bit
dan Brassica napus
1984 Transformasi sel tanaman dengan DNA plasmid
1985 Infeksi dan transformasi potongan daun dengan Agrobacterium
tumefaciens dan regenerasi tanaman yang mengalami transformasi
Sejak tahun 1980-an sampai sekarang, teknik kultur jaringan tanaman sudah
berkembang sangat pesat di seluruh penjuru dunia sehingga sulit untuk dipantau.
Terlebih lagi, banyak terobosan yang memiliki nilai komersial tinggi yang
diciptakan oleh institusi-institusi riset pada berbagai perusahaan besar yang
tidak dipublikasikan. Pemanfaatan yang nyata dari teknik tersebut, disamping
untuk perbanyakan tanaman, juga di bidang rekayasa genetika (genetic
engineering) untuk perbaikan mutu genetika tanaman pertanian. Sudah banyak varietas, bahkan spesies baru yang diciptakan melalui teknik
fusi protoplas. Demikian pula dengan aplikasi teknik tersebut pada eliminasi
penyakit, terutama penyakit virus dan produksi metabolit sekunder dengan
bantuan Agrobacterium sudah menjadi teknik yang rutin dilakukan oleh
para pakar di berbagai penjuru dunia, termasuk Indonesia. Hanya saja aplikasi
teknik kultur jaringan untuk pelestarian plasma nutfah tampaknya masih harus
menempuh perjalanan panjang untuk sampai pada sasaran yang diharapkan.
B. TERMINOLOGI
Kultur jaringan (tissue culture) sampai saat ini digunakan sebagai suatu
istilah umum yang meliputi pertumbuhan kultur secara aseptik dalam wadah yang
umumnya tembus cahaya. Sering kali kultur aseptik disebut juga kultur in
vitro yang artinya sebenarnya adalah kultur di dalam gelas.
Pemahaman terhadap istilah-istilah yang sering digunakan dalam kultur in
vitro merupakan suatu hal yang sangat mendasar. Istilah-istilah yang sering
digunakan dalam kultur jaringan adalah sebagai berikut;
1. Bahan tanam
yang digunakan dalam kultur jaringan biasanya disebut dengan eksplan.
2. Kalus; a) suatu
jaringan yang tersusun oleh sel-sel terdediferensiasi yang umumnya dihasilkan
oleh jaringan yang luka atau kultur jaringan pada media yang berisi auksin
tertentu, atau b) pertumbuhan aktif massa sel yang belum dan terdiferensiasi dan
tidak terorganisir yang berkembang dari jaringan luka atau kultur jaringan yang
ditanam pada media dengan tambahan zat pengatur tumbuh.
3. Dalam kultur
jaringan sering dilakukan pemindahan eksplan dari media I (untuk induksi kalus)
ke media II (media untuk induksi organ tunas dan akar). Pemindahan eksplan dari
media satu ke media lain (baik jenis medianya sama atau lain) dikenal dengan
istilah sub kultur.
4.
Setiap masa inkubasi disebut passage. Passage
pertama adalah sub kultur pertama dari jaringan yang terbentuk dari eksplan
awal.
5. Bahan yang
diambil pada setiap sub kultur disebut inokulum.
6. Kultur asenik
adalah kultur dengan hanya satu macam organisme yang diinginkan.
7. Eksplan yang
ditanam pada media tumbuh yang tepat, dapat beregenerasi melalui proses yang
disebut organogenesis atau embriogenesis. Oraganogenesis adalah proses
terbentuknya organ-organ seperti pucuk dan akar.
8. Pucuk yang
terbentuk pada tempat yang ukan jaringan asalnya (origin) yang biasa disebut
pucuk adventif. Seperti pucuk yang terbentuk dari kalus, hipokotil, kotiledon,
dan akar.
9.
Embriogenesis adalah proses terbentuknya embrio
somatik
10. Embrio somatik (nonzygotic embryo) adalah embrio yang bukan berasal dari
zigot, tetapi dari sel tubuh tanaman.
11. Bila embrio terbentuk dari kultur anther atau mikrospora disebut
androgenesis, bila berasal dari ovari yang belum mengalami fertilisasi
disebutgynogenesis.
12. Anakan tanaman yang telah lengkap
memiliki organ daun, batang dan akar hasil kultur jaringan disebut planlet
(plantula).
13. Plantula yang akan dipindah ke
lapangan dan diperlakukan sebagai bibit, harus mengalami masa adaptasi dari
kultur heterotropik menjadi kultur autotropik. Masa adaptasi plantula disebut
dengan aklimatisasi.
14. Pucuk-pucuk yang terbantuk dari
jaringan kalus, terutama yang sudah mengalami sub kultur, dapat bervariasi.
Variasi-variasi ini disebut variasi somaklonal. Penyebab variasi ini belum
diketahui dengan pasti, ada kemungkinan variasi ini sudah ada dalam eksplan
asal karena sifat kromosom mosaik dalam sel-sel somatik ataupun terjadi akibat
lingkungan di dalam kultur.
15. Salah satu variasi yang terjadi
adalah tanaman yang aneuploid yaitu tanaman yang jumlah kromosommya 2n-1 atau
2n+1.
16. Sel-sel dalam kalus atau sel-sel
dari jaringan daun siisolasi dengan perlakukan enzim meupakan bahan untuk
memperoleh protoplasma. Protoplasma-protoplasma diperoleh dengan menghilangkan
dinding sel dengan bantuan enzim-enzim cellulase, hemicellulase dan pektinase.
Propoplasma kemudian dapat ”dipaksa” untuk saling menempel dan bersatu
membentuk suatu fusi sel. Proses ini merupakan bidang pemulaiaan yang disebut
hibridisasi genetik.
17. Hasil gabungan dua atau lebih
protoplasma yang berbeda jenis dengan inti-intinya dikenal dengan istilah
heterokarion.
18. Bila hanya sitoplasma yang
bergabung maka disebut cybrid.
C. Prinsip Dasar
Kultur jaringan sesuai dengan definisinya sebagai
teknik budidaya sel, jaringan, dan organ tanaman dalam suatu lingkungan yang terkendali
dan dalam keadaan aseptik atau bebas mikroorganisme, mengandung dua prinsip
dasar yang jelas yaitu; 1) Bahan tanam yang bersifat totipoten dan 2) budi daya
yang terkendali.
1) Bahan tanam
yang bersifat totipotensi.
Konsep dasar
ini adalah mutlak dalam pelaksanaan kegiatan kultur jaringan karena hanya
dengan sifat totipotensi ini, sel, jaringan, organ yang digunakan akan mapu
tumbuh dan berkembang sesuai arahan dan tujuan budidaya in vitro yang
dilakukan. Umumnya sifat totipotensi lebih banyak dimiliki oleh bagian tanaman
yang masih juvenil, muda, dan banyak dijumpai pada daerah-daerah
meristem tanaman. Tetapi tidak menutup kemungkinan bagian tanaman yang sudah
dewasa bila mendapat lingkungan yang cocok akan bertotipotensi sehingga mampu
tumbuh dan berkembang. Pada keadaan tersebut bisa terjadi karena pada keadaan in
vitro tanaman mampu melakukan aktifitas dediferensiasi yaitu proses
perkembangan balik dari bagian dewasa tanaman menjadi sekolompok sel yang terus
menerus membelah (disebut kalus) atau bisa pula menjadi zigot. Selain itu juga
dapat terjadi rediferensiasi yaitu proses tumbuh dan berkembangnya kembali
kalus atau zigot tersebut tumbuh dan berkembang membentuk spesialisasi ke arah
terbentuknya akar, daun atau tunas hingga menjadi tanaman lengkap.
Kondisi
totipotensi bahan tanam antara satu tanaman dengan tanaman yang lain sangat
berbeda, bahkan perbedaan juga mungkin terjadi pada satu tanaman yang sejenis.
Perbedaan dalam hal cara, waktu dan musim pengambilan bahan tanam juga memberi
pengaruh pada keberhasilan kegiatan kultur jaringan. Penanganannya ada yang
mudah dan adapula yang sangat sulit. Yang banyak dilakukan dan dianggap relatif
mudah misalnya tanaman wortel, beberapa jenis anggrek, bawang, tembakau,
pisang. Beberapa yang dikenal sulit misalnya mangga, salak, bambu dan tanaman
lain yang umumnya mengandung fenolat tinggi atau bisa juga rendah kemampuan
berdiferensiasi dan rediferensiasinya.
Bahan tanam
yang sementara ini umum digunakan dalam kegiatan kultur jaringan dan sering
terbukti dapat tumbuh dan berkembang adalah:
a) Sel, bahan ini biasanya ditanam
dalam bentuk suspensi dengan kepadatan yang telah ditentukan. Paling umum
sel-sel ini diambil dari kalus, agar membentuk agregat kecil atau sel tunggal
maka kalus dimasukkan dalam media cair kemudian disentrifugasi berulang atau
bisa juga dengan prosedur enzimatik.
b) Protoplas, bahan ini biasanya
juga ditanam dalam bentuk suspensi dengan kepadatan yang telah ditentukan.
Mesofil daun, teras batang, kalus adalah bagian tanaman yang umum dipakai
sebagai sumber propolas. Untuk mendapatkan suspensi protoplas harus digunakan
medium yang mengandung enzim (enzimztic medium), proses pencucian dengan medium
pencuci (washing medium), sentrifugasi dan kemudian purifikasi.
c) Jaringan meristem, adalah
merupakan jaringan tanaman yang terdapat pada daerah-daerah pertumbuhan. Ciri
jaringan ini tersusun oleh sekelompok sel yang terus menerus membelah, sehingga
belum ada spesialisasi bentuk dan fungsi dari sel-sel yang menyususnnya. Pada
derah apikal meristem ada daerah yang sangat kecil terdiri dari sel-sel yang
sangat progresif sebagai titk pertumbuhan dan dikenal sebagai meristem dome.
Meristem ini hanya dapat diisolasi di bawah mikroskop dan terbukti baik sebagai
bahan untuk mendapat tanaman yang bebas bakteri dan virus.
d) Kalus, adalah merupakan masa sel
yang aktivitas pembelahannya tidak terkendali dan belum terdiferensiasi.
Sel-sel ini secara alamiah muncul dan tumbuh akaibat proses perlakuaan atau
akibat perlakuan tertentu dalam kultur jaringan. Bahan ini sangat potensial
untuk digunakan dalam berbagai kegiatan kultur lanjutan.
e) Organ, bahan ini adalah bahan
yang paling umum digunakan dalam kegiatan kultur jaringan. Bahan ini meliputi:
daun, batang, akar, biji, tunas, embrio, anther, kepala sari, dan lain
sebagainya. Bahan-bahan ini ada yang memang langsung digunakan untuk
mendapatkan produk yang diinginkan tetapi ada juga yang hanya digunakan sebagai
bahan kultur awal sehingga hanya sebagai jalan untuk mendapatkan organ juvenil,
atau kalus yang umumnya relatif bersifat meristematik dan steril.
2) Budidaya yang
terkendali.
Sifat bahan
yang totipotensi saja tidak cukup intuk kesuksesan kegiatan kultur jaringan.
Keadaan media tempat tumbuh, lingkungan yang mempengaruhinya (kelembaban,
temperatur, cahaya) serta keharusan sterilitas adalah hal mutlak yang harus
terkendali.
Konsep dasar
yang kedua ini harus difahami benar. Informasi mengenai kultur yang akan
dilakukan harus banyak dicari. Mulai dari media dasar apa yang digunakan, perlu
modifikasi atau tidak, bagaimana komponen dan takaran vitamin yang ditambahkan,
mau padat atau cair, akan ada perlakuan hormon atau tidak, berapa konsentrasi
yang digunakan, hormon tunggal atau kombinasi, berapa pH media, seberapa banyak
akan dibuat dan lain sebagainya. Pertanyaan-pertanyaan seperti ini layak
dilakukan dan harus dicari jawabannya sebelum melangkah pada kegiatan
teknisnya.
Agar pengaruh
lingkungan terkendali maka harus ditentukan bagaimana pencahayaan yang
diperlukan, baik dari intensitas maupun periodisasi pencahayaannya. Pastikan
dan catat fluktuasi perubahan temperatur ruangan kultur, sesuaikan dengan
kebutuhan yang diperlukan. Pada laboratorium-laboratorium yang maju pengadaan
generator untuk mengantisipasi terjadinya gangguan aliran listrik umumnya
sangat prioritas. Sedangkan untuk menjamin sterilitaskegiatan kultur jaringan
yang terdiri dari sterilitas bahan tanam, media tanam, alat-alat, ruang tabur,
laminar air flow, ruang inkubator, ruang kultur dan lain-lain dilakukan secara
spesifik.
Untuk bahan
tanam umumnya sterilisasi dilakukan dengan menggunakan bahan kimia misalnya:
alkohol, kalsium hipoklorit, Natrium hipoklorit, Hidrogen peroksida, Merkuri
klorid, Fungisida, Bakterisida, Betadin, Bayclin. Konsentrasi yang digunakan
dan lamanya perendaman antara satu dengan yang alinnya berbeda-beda, ada
yang digunakan pada konsentrasi yang rendah karena sangat beracun (mercury
clorid) hanya diperlukan 0,1-0,2 persen dengan lama perendaman 10-20 menit.
Sedangkan alkohol yang diperlukan berkonsentrasi 70 % dan lama
perendamannya hanya ½ hingga 1 menit saja. Namun demikian penentuan sterilan,
konsentrasi dan lamanya perendaman ditentukan oleh keadaan dari bahan tanam.
Seringkali diperlukan kajian tersendiri untuk dapat menentukan bahan sterilan,
konsentrasi dan lamanya perendaman. Tahapan ini penting menjadi perhatian
karena kecorobohan akan membawa keadaan bahan tanam tidak steril atau rusak
hingga tidak tumbuh.
Untuk
sterilisasi peralatan dan media yang hendak dipakai biasanya dilakukan dengan
menggunakan alat yang disebut Autoclave. Alat ini bekerja atas dasar
temperatur dan tekanan. Ada yang kerjanya menggunakan listrik dan ada pula yang
menggunakan kompor gas. Temperatur yang digunakan untuk sterilisasi adalah 121о
C dengan tekanan antara 15 – 18 psi (pounds per squar inch) selama 15 menit.
Sedangkan sterilisasi ruang transfer/penabur, ruang inkubasi, ruang kultur
umumnya dilakukan dengan menggunakan sinar ultra violet. Khusus untuk laminar
air flow biasanya sebelum penggunaan dibersihkan dengan alkohol 70 % kemudian
lampu ultra violet dinyalakan selama 1 – 2 jam.
Perpaduan
prinsip bahan tanam yang totipoten dan budidaya yang terkendali harus pula
diimbangi penguasaan teknik prosedur kerja yang baik. Kehati-hatian,
kecermatan, kketekunan dan usaha preventif menjaga kemungkinan terjadinya
kontaminasi adalah sikap yang sangat penting dikembangkan dalam kegiatan ini.
D. Tipe-Tipe Kultur Jaringan
Dalam pelaksanaannya teknik kultur jaringan dijumpai beberapa tipe sebagai
berikut:
1. Kultur biji (seed culture),
merupakan budidaya yang bahan tanamnya menggunakan biji atau seedling
2. Kultur organ (organ culture),
merupakan budidaya yang bahan tanamnya menggunakan organ seperti; ujung akar,
pucuk aksilar, tangkai daun, helaian daun, bunga, buah muda, inflorescentia,
buku batang, akar dll
3. Kultur kalus (callus culture),
merupakan kultur yang menggunakan jaringan (sekumpulan sel) biasanya berupa
jaringan parenkim sebagai eksplannya.
4. Kultur suspensi sel (suspension
culture) adalah kultur yang menggunakan media cair dengan pengecokan yang terus
menerus menggunakan shaker dan menggunakan sel atau agregat sel sebagai bahan
eksplannya, biasanya eksplan yang digunakan berupa kalus atau jaringan
meristem.
5. Kultur protoplasma, eksplan yang
digunakan adalah sel yang telah dilepas bagian dindingnya menggunakan bantuan
enzim. Protoplas diletakkan pada media padat dibiarkan agar membelah diri dan
membentuk dinding selnya kembali. Kultur protoplas biasanya untuk keperluan
hibridisasi somatik atau fusi sel soma (fusi dua protoplas baik intraspesifik
maupun interspesifik)
6. Kultur haploid adalah kultur yang
berasal dari bagian reproduktif tanaman yakni: kepala sari/anther (kultur
anther/kultur mikrospora), tepungsari/pollen (kultur pollen), ovule (kultur
ovule), sehingga dapat dihasilkan tanaman haploid.
Kultur in
vitro memiliki peranan yang sangat penting untuk mendapatkan hasil-hasil
yang tidak mungkin dicapai melalui kultur in vivo. Berikut ini disajikan
aplikasi sejumlah metode kultur jaringan beserta tujuan dari aplikasi tersebut
sebagaimana diuraikan oleh Pierik 1997 (dalam Zulkarnain, 2009).
Beberapa tipe kultur dan
tujuannya berdasarkan macam jaringan atau organ yang digunakan
|
Tipe Kultur
|
Tujuan
|
|
Kultur embrio
|
- Mempersingkat siklus pemuliaan tanaman
- Mengatasi aborsi embrio
- Mengatasi inkompatibilitas
- Sebagai sumber pembentukan kalusw
|
|
Kultur biji anggrek
|
- Mempersingkat siklus pemuliaan
- Menggantikan simbiosis (mikoriza)
- Meniadakan kompetisi dengan mikroorganisme lain
|
|
Kultur meristem
|
- Eliminasi
patogen (virus, cendawan, dan bakteri)
- Perbanayakan
vegetatif pada anggrek melalui protocorm-like bodies (plb)
- Perbanyakan
klon tanaman selain anggrek
- Penyimpanan
tanaman bebas penyakit
- Pengangkutan
fotosintat
- Koleksi
plasma nutfah
|
|
Kultur tunas dan buku tunggal
|
- Perbanyakan
anggrek
- Percabangan
aksilar sebagai sarana perbanyakan klon tanaman
- Kreopreservasi
untuk membuat bank gen
|
|
Kultur eksplan tanpa buku
|
- Pembentukan
organ vegetatif untuk perbanyakan klon tanaman
- Mendapatkan
tanaman bebas penyakit
- Isolasi
mutan
- Mengatasi
masalah kimera
- Mendapatkan
poliploidi
|
|
Kultur kalus dan suspensi sel
|
- Perbanyakan
klon tanaman melalui pembentukan organ dan embrio
- Regenerasi
varian-varian genetika
- Mendapatkan
tanaman bebas virus
- Sebagai
sumber untuk produksi protoplas
- Sebagai
bahan awal untukkreopreservasi
- Produksi
metabolit sekunder
- Biotransformasi
|
|
Kultur anthera dan mikrospora
|
- Produksi
tanaman haploid dan mendapatkan tanaman homozigot
- Sebagai titik
awal untuk induksi mutasi
- Mendapatkan
tanaman mandul yang semuanya berjenis kelamin jantan
- Sebagai
sarana manipulasi genetika
- Melakukan
pemuliaan pada tingkat ploidi yang rendah
|
|
Kultur ovul
|
- Mengatasi
inkompatibilitas
- Mengatasi
absisi bunga yang terlalu dini
- Mendapatkan
pembuahan secara in vitro
|
|
Kultur protoplas
|
- Hibridisasi
somatik (melalui fusi protoplas)
- Penciptaan
hibrida sel (cybrid)
- Pencangkokan
inti, kromosom dan organel-organel sel
- Penelitian
transformasi
- Regenerasi
varian-varian genetika
|
|
Kultur sel, jaringan dan organ
|
Sebagai sarana pada penelitian
penyakit tanaman:
- Penetrasi dan replikasi virus
- Kultur
parasit obligat
- Interaksi
inang-parasit
- Kultur
nematoda (kultur potongan akar)
- Pengujian
fitotoksin
- Penelitian
pembentukan nodul
Sebagai sarana pada penelitian
fisiologi tanaman:
- Penelitian siklus sel
- Metabolisme tanaman
- Penelitian nutrisi
- Penelitian morfogenetik dan perkembangan
|
